如何的進(jìn)行核酸提???
更新時(shí)間:2019-06-11 點(diǎn)擊次數(shù):3105次
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核酸提取的常見難點(diǎn)在于一些植物組織之所以比較難提取出高質(zhì)量的RNA與這些植物組織中富含的一些成份有關(guān),常見的有酚類化合物,多糖以及某些尚無法確定的次級代謝產(chǎn)物,另外還有就是富含較高活性的組織。在完整的細(xì)胞內(nèi),這些物質(zhì)與核酸是分離的,一旦細(xì)胞破碎,這些物質(zhì)就會與RNA相互作用。
核酸提取方法:
1. 迅速滅活內(nèi)源的RNA酶,以防止RNA降解。以下3個(gè)方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活:
1)用含離液(如胍鹽)的細(xì)胞裂解液收獲樣品,并立即勻漿。
2)用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是:組織塊必須保證足夠小,在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié),以確保瞬間令RNA酶失活。
3)立即將樣品置于無液氮RNA樣品儲存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑,能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠薄(<0.5 cm),這樣才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。
2. 使用正確的細(xì)胞或組織儲存條件
在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后,應(yīng)該儲存在-80°C,千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍,也會導(dǎo)致RNA的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該先在超低溫條件下先研磨成粉,然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。
4. 選擇好的RNA分離方法
現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前簡單也是安全的方法是柱式分離,如因?yàn)椴僮骱唵危瑫r(shí)間短,純度高而受到大家的喜愛,不需要DNA酶消化DNA,節(jié)省了時(shí)間,避免RNA的降解,從而提高了核酸提取產(chǎn)量;相對非柱式分離,去除蛋白及其他雜質(zhì)干凈,提高了純度,對于細(xì)胞、組織、一般植物均非常適合。植物核酸提取比較難抉擇,植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質(zhì)、次生代謝物含量的影響,可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等)和通用植物RNA提取試劑盒(適合絕大多數(shù)植物提取,包括:蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹、杉樹、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍(lán)、牽牛花等);非常值得一提的是血液(包括血清、血漿、腦脊液、其他液體)核酸提取用TRIZOL和紅細(xì)胞裂解的方法效果都不好,紅細(xì)胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分,這個(gè)過程RNA很容易降解,推薦使用血液總RNA提取試劑盒。